伯豪生物華大時(shí)空轉(zhuǎn)錄組 FF 樣本 V1.3 產(chǎn)品服務(wù)解決方案，是同時(shí)以納米級(jí)分辨率和厘米級(jí)全景視場(chǎng)實(shí)現(xiàn)“組織到數(shù)據(jù)”的 整體解決方案，適用于新鮮冷凍（FreshFrozen，F(xiàn)F) 樣本。為幫助研究人員利用更高效的生化流程捕獲更多 的基因，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)和細(xì)胞變化過(guò)程的精準(zhǔn)解析，我們對(duì)該方案進(jìn)行了全面升級(jí)。  在保持 Stereo-seq 高檢測(cè)分辨率的基礎(chǔ)上，升級(jí)后的時(shí)空轉(zhuǎn)錄組 FF V1.3 的整體性能更優(yōu)異，可助力研究人員輕松獲得更多高質(zhì)量數(shù)據(jù)， 結(jié)合全新升級(jí)的數(shù)據(jù)分析工具 ， 真 正實(shí)現(xiàn) Cellbin 水平深入探索和揭示細(xì)胞基因表達(dá)的奧秘。

比較前期 V1.2 版本，升級(jí)后的時(shí)空轉(zhuǎn)錄組 FF V1.3 的整體性能更優(yōu)異，在保持原分辨率 500nm 基礎(chǔ)上，捕獲基因數(shù)顯著提升，工作流程更快速簡(jiǎn)便，可以輕松完成 CellBin 分析，實(shí)現(xiàn)真正意義上的空間單細(xì)胞分 析。目前，時(shí)空轉(zhuǎn)錄組 FF V1.3 兼容 1cm×1cm 和 0.5cm×0.5cm 的芯片，兩種尺寸都兼容同片 ssDNA 染色 /H&E 染色以及單細(xì)胞分割。

圖 Stereo-seq 芯片大小

1、Stereo-seq 芯片上布滿了數(shù)十億規(guī)則陣列排布的單鏈線球狀 DNA 納米球（DNA NanoBall，DNB）。DNB 是以單鏈環(huán)狀 DNA 為模版，經(jīng)過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增得到的產(chǎn)物，每個(gè) DNB 直徑為 220nm，兩個(gè) DNB 中心點(diǎn)間距 范圍為 500nm。 

2、通過(guò) DNBSEQ 技術(shù)對(duì)固定在芯片上的 DNB 進(jìn)行測(cè)序，得到 Coordinate ID(CID) 信息，CID 和 DNB 坐標(biāo) 位置一一對(duì)應(yīng)，可以通過(guò)建立 CID 與坐標(biāo)位置的映射關(guān)系，還原后續(xù)捕獲到的 mRNA 的空間為止。芯片上所有點(diǎn)的 CID 序列信息，都被編制成一個(gè)叫“MASK”的文件，這個(gè) MASK 文件包含了每個(gè)點(diǎn)上 CID 序列的信息，后續(xù)用于分析。

3、DNB 經(jīng) Stereo-seq 生物方法合成攜帶 CID 的 DNB 后鏈接分子編碼（Molecular ID，MID 用于區(qū)分不同 轉(zhuǎn)錄本）和 Poly T 序列，后續(xù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)游離 mRNA 的捕獲。 

4、組織樣本貼在芯片上，經(jīng)過(guò)透化、反轉(zhuǎn)錄、二鏈合成、建庫(kù)、測(cè)序等步驟，將樣本中的基因信息準(zhǔn)確獲取。

圖 Stereo-seq 技術(shù)原理

5、空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的核心是根據(jù)每個(gè)芯片上每個(gè) bin 的基因表達(dá)信息進(jìn)行聚類，然后將 bin（cell bin）根據(jù)坐標(biāo)位置序列放回到組織的圖像上，同時(shí)可以對(duì)每個(gè) gene 在組織上表達(dá)的空間位置進(jìn)行定位。Stereo-seq 分析軟件包括 Stereo-seq 分析流程軟件包（Stereo-seq Analysis Workflow, SAW）和 StereoMap（ImageStudio 已合并入 StereoMap）。SAW 主要用于分析空間基因表達(dá)數(shù)據(jù)，StereoMap 是一款 桌面端可視化軟件，可以實(shí)現(xiàn)圖像處理和交互式可視化探索。全新的分析軟件功能更加強(qiáng)大，操作更加簡(jiǎn)單、5 伯豪生物華大時(shí)空轉(zhuǎn)錄組 FF V1.3 基因表達(dá)解決方案易用，以單細(xì)胞級(jí)分辨率（CellBin）輕松解析基因表達(dá)空間特征、探索全轉(zhuǎn)錄組空間奧秘。伯豪生物除了提 供 bin 基因數(shù)和 UMI 數(shù)統(tǒng)計(jì)、切片 bin 聚類和聚類亞群 marker 基因分析等基礎(chǔ)和高級(jí)分析，同時(shí)還提供個(gè)性 化分析，如特定 pathway 功能富集分析等。

圖 聚類結(jié)果及切片 bin 位置分布展示

圖 每個(gè) bin 特異表達(dá)的基因數(shù)統(tǒng)計(jì)

6、結(jié)合組織區(qū)域分布對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘

大部分組織其實(shí)是有其特定的區(qū)域劃分的，比如說(shuō)大腦里有皮層、丘腦、海馬、脈絡(luò)叢等多個(gè)區(qū)域。 將組織的區(qū)域劃分和亞群（或細(xì)胞類型）的分布結(jié)合起來(lái)還是能發(fā)現(xiàn)很多有價(jià)值的信息的。 

可以根據(jù)不同區(qū)域特異表達(dá)的 maker 基因的分布來(lái)判斷每個(gè)區(qū)域在組織切片上的位置。 例如皮層 marker 基因 STX1A 的表達(dá)分布，海馬 marker 基因 HPCA 的表達(dá)分布等

7、結(jié)合病理學(xué)特征對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘  

空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)正真的精髓不是研究細(xì)胞亞群的分布，而在于將它在空間位置上體現(xiàn)的異質(zhì)性跟組 織病理學(xué)特征的分布進(jìn)行結(jié)合，挖掘在不同病理學(xué)特征下轉(zhuǎn)錄組學(xué)的差異。這對(duì)于研究疾病病變的機(jī)制、幫助臨床實(shí)現(xiàn)更好的患者分子分型、以及空間位置 Biomarker 的挖掘方面都是非常有價(jià)值的。通過(guò)手動(dòng)把這些區(qū)域圈出來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組層面的比較，找出不同病灶區(qū)的特異性 marker，分析疾病在一步步發(fā)展進(jìn)程中生物學(xué)功能的變化，甚至可以思考一下是否能找出一些關(guān)鍵性因子來(lái)阻斷疾病的進(jìn)展。

8、空間轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合單細(xì)胞 RNA 測(cè)序解析細(xì)胞類型的空間位置信息（Multimodal intersection analy-sis,MIA)

空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以獲得不同基因在組織切片上的空間位置信息，但不能獲得詳細(xì)的細(xì)胞類群信息（空間轉(zhuǎn)錄組不是單細(xì)胞分辨率，只能粗略的分析切片上不同位置的細(xì)胞類型）。因此，需要借助但細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)分析細(xì)胞類型，然后通過(guò)生物信息學(xué)的分析方法將單細(xì)胞類群映射到空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)上。

備注： MIA 熱圖，上方的顏色條反映了 ST 區(qū)域的子聚類（cancer region，Pancreatic tissue，Duct epithelium 和 stroma）。

左側(cè)代表不同的細(xì)胞類群。

色塊代表 enrichment 或者 depletion。

Enrichment 代表該細(xì)胞類群富集到了該區(qū)域。

Depletion 代表該細(xì)胞類群在該區(qū) 域缺失。

1、捕獲基因數(shù)顯著提升：

基于同組織相鄰切片、相同數(shù)據(jù)飽和度下，統(tǒng)計(jì)了已測(cè)試的所有組織樣本，Bin20 水平捕獲的 Median  Gene Type 提升中位數(shù)比例為~149%。Meidan MID 提升中位數(shù)比例為~224%。捕獲效率顯著提升，助力進(jìn)行更深入的單細(xì)胞空間分析。 

2、輕松實(shí)現(xiàn) Cellbin 分析： 

通過(guò)圖像識(shí)別技術(shù)，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行識(shí)別和分割并獲得 Celbin?；?Cellbin 水平捕獲到的更多空間轉(zhuǎn)錄組信息，以單細(xì)胞分辨率精細(xì)探索基因表達(dá)空間特征。

3、樣本質(zhì)量兼容性更高： 

RIN 值的質(zhì)控要求調(diào)整為 RIN≥4，允許檢測(cè)更多長(zhǎng)期保存的降解度更高的樣本，樣本質(zhì)量兼容性更高。

4、同試劑盒支持同片細(xì)胞核 /H& E 染色：

H&E 封片劑集成進(jìn)試劑盒，支持同一套試劑盒在同一張切片上靈活選擇 ssDNA 染色 /H&E 染色，開展多 模態(tài)數(shù)據(jù)分析及挖掘。 

5、有效提升透化熒光信號(hào)強(qiáng)度： 

透化試劑升級(jí)后，可以有效提升透化熒光信號(hào)強(qiáng)度，更有利于選擇最佳透化時(shí)間。

6、工作流程更快速便捷：

實(shí)現(xiàn)部分試劑預(yù)混，試劑管數(shù)減少，生化流程整體可縮短~4 小時(shí)，操作更簡(jiǎn)單流暢，研究人員 1 天即可獲得純化后的 cDNA 產(chǎn)物。

7、分析工具強(qiáng)大且易用  

全新升級(jí)的數(shù)據(jù)分析工具安裝配置和操作使用更簡(jiǎn)單便捷，交互友好性更強(qiáng)，可視化能力更豐富，可兼容所有第三方分割算法的結(jié)果。

1、新鮮組織樣本包埋  

目前新鮮組織的包埋方法有兩種，一種是液氮 + 異戊烷法；另一種的干冰法。對(duì)于臨床手術(shù)切下來(lái)的組織樣本一般使用干冰的包埋方法。對(duì)于穿刺樣本等一些較小，較輕的樣本，一般推薦用液氮 + 異戊烷的方法 進(jìn)行冷凍。OCT 包埋組織塊可以在?80oC 的密封容器中長(zhǎng)期保存，或立即進(jìn)行冷凍切片。有些樣本比較特殊：肺組織，腦（人 + 小鼠 + 大鼠）這種樣本取下后，不要放入在任何液體里，如果表面有血液，只需要用 PBS 沖洗擦干后，進(jìn)行包埋。 

2、冷凍切片、組織樣本質(zhì)控及貼片  

由于空間轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)的是組織中的 RNA，因此要對(duì)切片中的 RNA 質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。我們一般取 10 片組織切片進(jìn)行 RNA 抽提并質(zhì)檢，確定組織中 RNA 完整性（華大 V1.3：RIN>4）。所以要求我們的組織樣本至少有 1cm 的厚度，以便完成所有的實(shí)驗(yàn)。 

3、組織優(yōu)化  

進(jìn)行組織優(yōu)化芯片探索的目的是摸索樣本的最佳透化條件，保證組織切片中的 mRNA 能夠充分釋放。該步驟是獲取真實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的必要條件。否則，我們無(wú)法判斷是基因表達(dá)高低到底是否是因?yàn)橥富怀浞謱?dǎo)致。因此：每個(gè)樣本建議都要做透化，尤其是臨床樣本。

空間位置信息，或者細(xì)胞在組織中天然的狀態(tài)在研究過(guò)程中其實(shí)具有十分重要的價(jià)值，特別針對(duì)某些 研究領(lǐng)域，如發(fā)育生物學(xué)（不同位置的細(xì)胞接受不同的信號(hào)濃度梯度、響應(yīng)不同的外界刺激，具有不同的發(fā) 育命運(yùn)）、腫瘤生物學(xué)（腫瘤組織與癌旁組織的區(qū)別，腫瘤細(xì)胞侵潤(rùn)過(guò)程中腫瘤細(xì)胞的變化與對(duì)正常細(xì)胞的 影響，腫瘤轉(zhuǎn)移的不同過(guò)程階段等）、腦神經(jīng)科學(xué)（不同腦區(qū)位置的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)、神經(jīng)連結(jié)，中間神經(jīng)元投射，突觸前后，神經(jīng)膠質(zhì)相互影響等等），細(xì)胞來(lái)源的位置信息是極為關(guān)鍵的決定因素。常見空間轉(zhuǎn)錄組的應(yīng)用方向主要在腫瘤學(xué)，免疫學(xué)，發(fā)育生物學(xué)，神經(jīng)科學(xué)及病理學(xué)等方向。

圖   空間轉(zhuǎn)錄組的應(yīng)用方向

  截止 2024 年 5 月，利用 DNBelab C 系列高通量單細(xì)胞 RNA 測(cè)序技術(shù)進(jìn)行研究發(fā)表的文章累計(jì) 80 多篇，尤其是在 Nature，Cell，Cell Research，Immunity 等國(guó)際頂刊也發(fā)表過(guò)多篇代表性文章。

文獻(xiàn)案例 1:

Cell 突破！中國(guó)科學(xué)家首次重構(gòu)高分辨率人類數(shù)字 3D 原腸胚  

 3D reconstruction of a gastrulating human embryo[3]

發(fā)表雜志：Cell 

影響因子：45.6 

發(fā)表時(shí)間：2024 年 5 月  

摘要： 原腸運(yùn)動(dòng)（gastrulation）是指大部分動(dòng)物胚胎發(fā)育中都會(huì)經(jīng)歷的一個(gè)階段。在本階段中，只有一 層細(xì)胞的囊胚會(huì)發(fā)生重組，形成一個(gè)含有三個(gè)胚層（即外胚層 ectoderm、中胚層 mesoderm、內(nèi)胚層 endoderm）的結(jié)構(gòu)，而新形成的三個(gè)胚層細(xì)胞會(huì)組合并協(xié)調(diào)發(fā)育為各種器官。每一個(gè)胚層的細(xì)胞都能發(fā)育 為特定的器官和組織。研究者基于 Stereo-seq 對(duì)一個(gè)完整的 CS8 原腸胚胚胎及進(jìn)行冷凍切片并測(cè)序，得到 從前端到后端完整的空間轉(zhuǎn)錄組信息，結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)算法進(jìn)行三維對(duì)齊，形成整個(gè) CS8 胚胎的三維空間轉(zhuǎn) 錄組圖譜，從而實(shí)現(xiàn)完整的胚胎 3D 構(gòu)建。通過(guò)對(duì)基因三維分布和參與原腸胚形成過(guò)程的基本細(xì)胞進(jìn)行分析，研究者對(duì)不同的細(xì)胞亞型進(jìn)行注釋，關(guān)注了有關(guān)的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并探討了 CS8 胚胎中重要發(fā)育事件

文獻(xiàn)案例 2：

Stereo-seq 繪制小鼠器官發(fā)生圖譜  

Spatiotemporal transcriptomic atlas of mouse organogenesis using DNA nanoball-patterned arrays.[4]

發(fā)表雜志：Cell  

影響因子：45.6 

發(fā)表時(shí)間：2022 年 5 月  

摘要： 結(jié)合 DNA 納米球（DNB）模式陣列和原位 RNA 捕獲技術(shù)，建立了 Stereo-seq（SpaTial Enhanced  REsolutionOmics-sequencing）技術(shù)，相較當(dāng)前其他空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，該技術(shù)擁有最大的捕獲面積（最大 174.24 cm2）、最靈敏的基因捕獲（1,450 個(gè) UMI/100μm2）和單細(xì)胞分辨率；應(yīng)用 Stereo-seq 對(duì) C57BL/ 6 小 鼠胚胎發(fā)育第 9.5 天（E9.5）至第 16.5 天（E16.5）產(chǎn)出了共 53 張矢狀切面的轉(zhuǎn)錄組圖譜，其中包括來(lái)自同一個(gè) E16.5 胚胎的 13 張連續(xù)切片，并進(jìn)一步描述了小鼠胚胎發(fā)育中晚期的器官發(fā)育基因的空間表達(dá)模式以及器 官發(fā)育的軌跡，構(gòu)建了小鼠器官發(fā)生時(shí)空轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（MOSTA）；基于核酸染色影像進(jìn)行細(xì)胞邊界識(shí)別，獲取了 E16.5 小鼠全胚胎具于空間位置的單細(xì)胞時(shí)空轉(zhuǎn)錄組信息，并在同一張切片上鑒定了 4 種上皮細(xì)胞 亞型和 6 種成骨細(xì)胞亞型的空間分布情況，描述了前腦的抑制性神經(jīng)元從內(nèi)側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起至皮層的遷移軌 跡；在 E12.5、E14.5 以及 E16.5 小鼠的背側(cè)中腦描述了中腦發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞分布異質(zhì)性，并在中腦的腦室 區(qū)發(fā)現(xiàn)中腦區(qū)域放射狀膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞祖細(xì)胞或膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞兩個(gè)分支的分化軌跡以及在中腦發(fā) 育過(guò)程中的時(shí)間分布異質(zhì)性，找到了決定放射狀膠質(zhì)細(xì)胞分別向兩個(gè)分支發(fā)育的關(guān)鍵微環(huán)境因子和調(diào)控 因子；利用 Stereo-seq 構(gòu)建的小鼠中晚期的胚胎時(shí)空轉(zhuǎn)錄組圖譜，描述了人類發(fā)育缺陷相關(guān) 1,959 個(gè)基因 在小鼠胚胎中表達(dá)模式，并在單細(xì)胞精度下研究了由 WNT5A 基因突變導(dǎo)致的羅賓諾綜合征（Robinow  Syndrome）在小鼠上顎和肢體中累及的細(xì)胞類型，證明了應(yīng)用 MOSTA 解析發(fā)育過(guò)程中疾病相關(guān)基因表達(dá) 的時(shí)空窗口和潛在累及細(xì)胞和器官方面的潛力。

文獻(xiàn)案例 3：

基于 scStereo-seq 技術(shù)揭示擬南芥葉片中區(qū)域特異性細(xì)胞亞型和單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組分析  

The Single-cell Stereo-seq reveals region-specific cell subtypes and transcriptome profiling in Arabidopsis leaves.[5]

發(fā)表雜志：Developmental Cell

影響因子：10.7 

發(fā)表時(shí)間：2022 年 5 月  

摘要： 基于 Stereo-seq 技術(shù)，結(jié)合植物細(xì)胞具有細(xì)胞壁這一特性，建立了廣泛適用于植物的單細(xì)胞空 間轉(zhuǎn)錄組技術(shù) scStereo-seq（single-cell SpaTial Enhanced REsolution Omics-sequencing），首次在植 物研究領(lǐng)域中應(yīng)用并繪制了擬南芥（Arabidopsis）葉片的單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組圖譜；植物單細(xì)胞研究中，存 在部分細(xì)胞亞型因分子特征高度相似，而難以有效地區(qū)分和研究的問題，scStereo-seq 應(yīng)用于擬南芥莖生 葉橫切面，成功將高度相似的細(xì)胞亞型進(jìn)行有效區(qū)分和分子特征的解析（如表皮細(xì)胞中的上表皮細(xì)胞和下 表皮細(xì)胞，葉肉細(xì)胞中的柵欄細(xì)胞和海綿細(xì)胞）；首次從單細(xì)胞水平揭示了光合作用相關(guān)基因（PQL1、LHCA6、PSB29、PPL2、FNR1）的表達(dá)水平在空間上呈現(xiàn)從主葉脈到葉邊緣方向上的梯度變化的趨勢(shì)；利用 細(xì)胞空間位置信息，構(gòu)建了不同類型細(xì)胞的空間發(fā)育軌跡，發(fā)現(xiàn)在維管細(xì)胞中，主葉脈區(qū)域的細(xì)胞相較于 葉邊緣細(xì)胞，占有更高比例的分化程度較低的細(xì)胞；而在表皮細(xì)胞和保衛(wèi)細(xì)胞的發(fā)育軌跡未能觀察到明顯 的空間分布差異特征。

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